Diferença Chave - Sequenciamento Sanger vs Pirosequenciamento
O sequenciamento do DNA é muito importante para a análise do DNA, uma vez que o conhecimento do arranjo correto dos nucleotídeos em uma determinada região do DNA revela muitas informações importantes sobre ele. Existem diferentes métodos de sequenciamento de DNA. O sequenciamento Sanger e o piroosquenciamento são dois métodos diferentes de sequenciamento de DNA amplamente usados em Biologia Molecular. A principal diferença entre o sequenciamento Sanger e a pirosequenciamento é que o sequenciamento Sanger usa didesoxinucleotídeos para encerrar a síntese de DNA para ler a sequência de nucleotídeos, enquanto a pirosequenciamento detecta a liberação de pirofosfato incorporando os nucleotídeos e sintetizando a sequência complementar para ler a ordem precisa da sequência.
CONTEÚDO
1. Visão geral e diferença fundamental
2. O que é sequenciamento Sanger
3. O que é pirosequenciamento
4. Comparação lado a lado - Sequenciamento Sanger vs pirosequenciamento
5. Resumo
O que é sequenciamento de Sanger?
O sequenciamento Sanger é um método de sequenciamento de DNA de primeira geração desenvolvido por Frederick Sanger e seus colégios em 1977. Também é conhecido como Sequenciamento de Terminação de Cadeia ou Sequenciamento Dideoxi, uma vez que se baseia na terminação de cadeia por didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Este método foi amplamente utilizado por mais de 30 anos, até que o Sequenciamento de Nova Geração (NGS) foi desenvolvido. A técnica de sequenciamento Sanger possibilitou a descoberta da ordem correta dos nucleotídeos ou a fixação de um fragmento de DNA específico. É baseado na incorporação seletiva de ddNTPs e terminação da síntese de DNA durante a replicação in vitro do DNA. A ausência de grupos 3 'OH para continuar a formação da ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes é uma característica única dos ddNTPs. Portanto, uma vez que o ddNTP é anexado, o alongamento da cadeia cessa e termina a partir desse ponto. Existem quatro ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP - usados no sequenciamento Sanger. Esses nucleotídeos interrompem o processo de replicação do DNA quando são incorporados à fita crescente de DNA e resultam em comprimentos variados de DNA curto. A eletroforese em gel capilar é usada para organizar essas fitas curtas de DNA por seus tamanhos em um gel, conforme mostrado na Figura 01.
Figura 1: Eletroforese em gel capilar de DNA curto sintetizado
Para a replicação in vitro de DNA, alguns requisitos devem ser fornecidos. Eles são enzima polimerase de DNA, DNA molde, primers de oligonucleotídeos e desoxinucleotídeos (dNTPs). No sequenciamento Sanger, a replicação do DNA é realizada em quatro tubos de ensaio separados, juntamente com quatro tipos de ddNTPs separadamente. Os desoxinucleotídeos não são totalmente substituídos pelos respectivos ddNTPs. Uma mistura do dNTP particular (por exemplo; dATP + ddATP) é incluída no tubo e replicada. Quatro produtos em tubo separados são executados em um gel em quatro poços separados. Em seguida, pela leitura do gel, a sequência pode ser construída conforme mostrado na Figura 02.
Figura 02: Sequenciamento Sanger
O sequenciamento de Sanger é uma técnica importante que ajuda em muitas áreas da biologia molecular. O projeto do genoma humano foi concluído com sucesso com a ajuda de métodos baseados em sequenciamento Sanger. O sequenciamento Sanger também é útil no sequenciamento de DNA alvo, pesquisa de câncer e doenças genéticas, análise de expressão gênica, identificação humana, detecção de patógenos, sequenciamento microbiano, etc.
Existem várias desvantagens do sequenciamento Sanger:
- O comprimento do DNA sendo sequenciado não pode ser superior a 1000 pares de bases
- Apenas uma fita pode ser sequenciada por vez.
- O processo é demorado e caro.
Portanto, novas técnicas avançadas de sequenciamento foram desenvolvidas com o tempo para superar esses problemas. No entanto, o sequenciamento Sanger ainda está em uso devido aos seus resultados altamente precisos de até fragmentos de comprimento de aproximadamente 850 pares de bases.
O que é pirosequenciamento?
O pirosequenciamento é uma nova técnica de sequenciamento de DNA baseada no “sequenciamento por síntese”. Esta técnica se baseia na detecção da liberação de pirofosfato na incorporação de nucleotídeos. O processo é empregado por quatro enzimas diferentes: DNA polimerse, ATP sulfurilase, luciferase e apirase e dois substratos adenosina 5 'fosfosulfato (APS) e luciferina.
O processo começa com a ligação do primer com o molde de DNA de fita simples e a DNA polimerase inicia a incorporação de nucleotídeos complementares a ele. Quando os nucleotídeos se unem (polimerização de ácido nucleico), ele libera grupos de pirofosfato (dois grupos de fosfato unidos) e energia. Cada adição de nucleotídeo libera quantidade equimolar de pirofosfato. O pirofosfato se converte em ATP pela ATP sulfurilase na presença do substrato APS. O ATP gerado conduz a conversão mediada por luciferase de luciferina em oxiluciferina, produzindo luz visível em quantidades que são proporcionais à quantidade de ATPs. A luz é detectada por um dispositivo de detecção de fóton ou por fotomultiplicador e cria um pirograma. A apirase degrada ATP e dNTPs não incorporados na mistura de reação. A adição de dNTP é feita uma vez por vez. Uma vez que a adição de nucleotídeos é conhecida de acordo com a incorporação e detecção de luz, a sequência do molde pode ser determinada. O pirograma é usado para gerar a sequência de nucleotídeos da amostra de DNA, conforme mostrado na Figura 03.
O pirosequenciamento é muito importante na análise de polimorfismo de nucleotídeo único e no sequenciamento de trechos curtos de DNA. A alta precisão, flexibilidade, facilidade de automação e processamento paralelo são as vantagens do pirosequenciamento sobre as técnicas de sequenciamento Sanger.
Figura 03: Pirosequenciamento
Qual é a diferença entre o Sequenciamento Sanger e o Piro-sequenciamento?
Artigo Diff meio antes da tabela
Seqüenciamento Sanger vs Pirosequenciamento |
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| O sequenciamento Sanger é um método de sequenciamento de DNA baseado na incorporação seletiva de ddNTPs pela DNA polimerase e terminação de cadeia. | A pirosequenciamento é um método de sequenciamento de DNA baseado na detecção da liberação de pirofosfato após a incorporação de nucleotídeo. |
| Uso de ddNTP | |
| ddNTPs são usados para encerrar a replicação do DNA | ddNTPs não são usados. |
| Enzimas envolvidas | |
| DNA polimerase são usados. | Quatro enzimas são usadas: DNA polimerase, ATP sulfurilase, luciferase e apirase. |
| Substratos usados | |
| APS e Luciferin não são usados. | Adenosina 5 'fosfosulfato (APS) e luciferina são usados. |
| Temperatura máxima | |
| Este é um processo lento. | Este é um processo rápido. |
Resumo - Sequenciamento Sanger vs Pirosequenciamento
O sequenciamento de Sanger e o pirosequenciamento são dois métodos de sequenciamento de DNA usados em biologia molecular. A sequenciação de Sanger constrói a ordem dos nucleotídeos em sequência, terminando o alongamento da cadeia, enquanto a pirosequenciação constrói a ordem precisa dos nucleotídeos em sequência por incorporação de nucleotídeos e detecção da liberação de pirofosfatos. Portanto, a principal diferença entre o sequenciamento Sanger e o piro-sequenciamento é que o sequenciamento Sanger funciona no sequenciamento por terminação da cadeia, enquanto o piro-sequenciamento funciona no sequenciamento por síntese.
