Diferença Entre Northern Southern E Western Blotting

2024 Autor: Mildred Bawerman | [email protected]. Última modificação: 2023-12-16 08:41

Diferença chave - Northern vs Southern vs Western Blotting

A detecção de sequências específicas de DNA, RNA e proteínas é essencial para vários tipos de estudos em Biologia Molecular. A eletroforese em gel é uma técnica que separa DNA, RNA e proteínas de acordo com seus tamanhos. A partir dos perfis de gel, determinada sequência de DNA, sequência de RNA ou proteína são detectadas por técnicas especiais chamadas de blotting e hibridização com sondas marcadas. Existem três tipos diferentes de métodos de blotting, nomeadamente sul, norte e oeste. A principal diferença entre o borrão norte, sul e oeste está no tipo de molécula que detecta em uma amostra. Southern blotting é um método que detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Northern blotting é uma técnica que detecta uma sequência específica de RNA de uma amostra de RNA. Western blotting é um método que detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína.

CONTEÚDO

1. Visão geral e principais diferenças

2. O que é Southern Blotting

3. O que é Northern Blotting

4. O que é Western Blotting

5. Comparação lado a lado - Northern vs Southern vs Western Blotting

6. Resumo

O que é Southern Blotting?

A técnica de Southern blotting foi desenvolvida por EM Southern em 1975 para a identificação de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Esta é a primeira técnica de blotting introduzida na biologia molecular. Ele permitiu a detecção de genes específicos do DNA, fragmentos específicos do DNA, etc. Existem várias etapas envolvidas na técnica de Southern blotting. Eles são os seguintes.

1. O DNA é isolado da amostra e digerido com endonucleases de restrição.
2. A amostra digerida é separada por eletroforese em gel de agarose.
3. Os fragmentos de DNA no gel são desnaturados em fitas simples pelo uso de uma solução alcalina.
4. O DNA de fita simples é transferido para uma membrana de filtro de nitrocelulose por transferência capilar.
5. O DNA transferido é fixado na membrana permanentemente.
6. O DNA fixado na membrana é hibridizado com sondas marcadas.
7. O DNA não ligado é removido da membrana por lavagem.
8. O filme de raios X é exposto à membrana e uma autorradiografia é preparada.

Southern blotting é aplicado para diferentes aspectos da biologia molecular. É útil no mapeamento RFLP, estudos forenses, metilação do DNA na expressão do gene, detecção de genes mutados em distúrbios genéticos, impressão digital de DNA, etc.

Figura 01: Técnica de Southern Blotting

O que é Northern Blotting?

Northern blotting é um método desenvolvido para detectar uma sequência específica de RNA ou sequência de mRNA de uma amostra para estudar a expressão gênica. Esta técnica foi desenvolvida por Alwine, Kemp e Stark em 1979. Ela difere das técnicas de sourthern e western blotting devido a várias etapas. No entanto, esta técnica também é realizada por meio de eletroforese em gel, blotting e hibridização com sondas marcadas específicas e detecção. A técnica de Northern blotting é realizada como segue.

1. O RNA é extraído da amostra e separado por eletroforese em gel.
2. O RNA é transferido do gel para uma membrana de blotting e fixado.
3. A membrana é tratada com uma sonda marcada preparada a partir de cDNA ou RNA (a sonda é complementar a uma sequência específica na amostra).
4. A sonda é incubada com a membrana para se ligar a uma sequência específica.
5. As sondas não ligadas são lavadas.
6. Os fragmentos hibridados são detectados por uma autorradiografia.

Northern blotting é uma ferramenta importante na detecção e quantificação de mRNA hibridizado, estudando a degradação do RNA, avaliação da meia-vida do RNA, detecção de splicing de RNA, estudo da expressão gênica, etc.

Figura 02: Northern Blotting

O que é Western Blotting?

Western blotting é um método de detecção de uma proteína específica de uma mistura de proteínas pelo uso de um anticorpo marcado. Portanto, western blot também é conhecido como immunoblot. Esta técnica foi introduzida por Towbin et al em 1979 e agora é rotineiramente realizada em laboratórios para análise de proteínas. As etapas são as seguintes.

1. As proteínas são extraídas da amostra
2. As proteínas são separadas por seus tamanhos usando eletroforese em gel de poliacrilamida
3. Moléculas separadas são transferidas para uma membrana de PVDF ou membrana de nitrocelulose por eletroporação
4. A membrana é bloqueada para ligação não específica com os anticorpos
5. As proteínas transferidas são ligadas ao anticorpo primário (anticorpos marcados com enzima).
6. A membrana é lavada para remover anticorpos primários ligados de forma não específica
7. Os anticorpos ligados são detectados adicionando um substrato e detectando o precipitado colorido formado

O Western blotting é útil na detecção de anticorpos anti-HIV em uma amostra de soro humano. O Western blot também pode ser usado como teste confirmatório para infecção por Hepatite B e teste definitivo para doença da vaca louca.

Figura 03: Western Blotting

Qual é a diferença entre Northern Southern e Western Blotting?

Artigo Diff meio antes da tabela

Northern vs Southern vs Western Blotting
Tipo de molécula detectada
Northern Blotting	O Northern blotting detecta uma sequência específica de RNA de uma amostra de RNA.
Southern Blotting	Southern blotting detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA.
Western Blotting	O Western blotting detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína.
Tipo de Gel
Northern Blotting	Este usa gel de agarose / formaldeído.
Southern Blotting	Isso usa um gel de agarose.
Western Blotting	Isso usa gel de poliacrilamida.
Método de Blotting
Northern Blotting	Esta é uma transferência capilar.
Southern Blotting	Esta é uma transferência capilar.
Western Blotting	Esta é uma transferência elétrica.
Sondas Usadas
Northern Blotting	sondas de cDNA ou RNA marcadas radioativa ou não radioativamente.
Southern Blotting	As sondas de DNA são marcadas radioativamente ou não radioativamente.
Western Blotting	Os anticorpos primários são usados como sondas.
Sistema de Detecção
Northern Blotting	Isso é feito usando uma autorradiografia ou detecção de mudança de luz ou cor.
Southern Blotting	Isso é feito usando uma autorradiografia, detecção de mudança de luz ou cor.
Western Blotting	Isso é feito usando a detecção de mudança de luz ou cor.

Resumo - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting é uma técnica especial desenvolvida para a identificação de DNA, RNA ou proteína específicos das amostras. Existem três procedimentos de blotting separados, nomeadamente norte, sul e oeste, para detectar um tipo específico de molécula. A técnica de Northern blotting é projetada para detectar uma sequência de RNA específica de uma mistura de RNA. A técnica de Southern blotting permite a detecção de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA e a técnica de Western blotting é desenvolvida para identificar uma proteína específica de uma mistura de proteínas.