Diferença chave - Northern vs Southern vs Western Blotting
A detecção de sequências específicas de DNA, RNA e proteínas é essencial para vários tipos de estudos em Biologia Molecular. A eletroforese em gel é uma técnica que separa DNA, RNA e proteínas de acordo com seus tamanhos. A partir dos perfis de gel, determinada sequência de DNA, sequência de RNA ou proteína são detectadas por técnicas especiais chamadas de blotting e hibridização com sondas marcadas. Existem três tipos diferentes de métodos de blotting, nomeadamente sul, norte e oeste. A principal diferença entre o borrão norte, sul e oeste está no tipo de molécula que detecta em uma amostra. Southern blotting é um método que detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Northern blotting é uma técnica que detecta uma sequência específica de RNA de uma amostra de RNA. Western blotting é um método que detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína.
CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é Southern Blotting
3. O que é Northern Blotting
4. O que é Western Blotting
5. Comparação lado a lado - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Resumo
O que é Southern Blotting?
A técnica de Southern blotting foi desenvolvida por EM Southern em 1975 para a identificação de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Esta é a primeira técnica de blotting introduzida na biologia molecular. Ele permitiu a detecção de genes específicos do DNA, fragmentos específicos do DNA, etc. Existem várias etapas envolvidas na técnica de Southern blotting. Eles são os seguintes.
- O DNA é isolado da amostra e digerido com endonucleases de restrição.
- A amostra digerida é separada por eletroforese em gel de agarose.
- Os fragmentos de DNA no gel são desnaturados em fitas simples pelo uso de uma solução alcalina.
- O DNA de fita simples é transferido para uma membrana de filtro de nitrocelulose por transferência capilar.
- O DNA transferido é fixado na membrana permanentemente.
- O DNA fixado na membrana é hibridizado com sondas marcadas.
- O DNA não ligado é removido da membrana por lavagem.
- O filme de raios X é exposto à membrana e uma autorradiografia é preparada.
Southern blotting é aplicado para diferentes aspectos da biologia molecular. É útil no mapeamento RFLP, estudos forenses, metilação do DNA na expressão do gene, detecção de genes mutados em distúrbios genéticos, impressão digital de DNA, etc.
Figura 01: Técnica de Southern Blotting
O que é Northern Blotting?
Northern blotting é um método desenvolvido para detectar uma sequência específica de RNA ou sequência de mRNA de uma amostra para estudar a expressão gênica. Esta técnica foi desenvolvida por Alwine, Kemp e Stark em 1979. Ela difere das técnicas de sourthern e western blotting devido a várias etapas. No entanto, esta técnica também é realizada por meio de eletroforese em gel, blotting e hibridização com sondas marcadas específicas e detecção. A técnica de Northern blotting é realizada como segue.
- O RNA é extraído da amostra e separado por eletroforese em gel.
- O RNA é transferido do gel para uma membrana de blotting e fixado.
- A membrana é tratada com uma sonda marcada preparada a partir de cDNA ou RNA (a sonda é complementar a uma sequência específica na amostra).
- A sonda é incubada com a membrana para se ligar a uma sequência específica.
- As sondas não ligadas são lavadas.
- Os fragmentos hibridados são detectados por uma autorradiografia.
Northern blotting é uma ferramenta importante na detecção e quantificação de mRNA hibridizado, estudando a degradação do RNA, avaliação da meia-vida do RNA, detecção de splicing de RNA, estudo da expressão gênica, etc.
Figura 02: Northern Blotting
O que é Western Blotting?
Western blotting é um método de detecção de uma proteína específica de uma mistura de proteínas pelo uso de um anticorpo marcado. Portanto, western blot também é conhecido como immunoblot. Esta técnica foi introduzida por Towbin et al em 1979 e agora é rotineiramente realizada em laboratórios para análise de proteínas. As etapas são as seguintes.
- As proteínas são extraídas da amostra
- As proteínas são separadas por seus tamanhos usando eletroforese em gel de poliacrilamida
- Moléculas separadas são transferidas para uma membrana de PVDF ou membrana de nitrocelulose por eletroporação
- A membrana é bloqueada para ligação não específica com os anticorpos
- As proteínas transferidas são ligadas ao anticorpo primário (anticorpos marcados com enzima).
- A membrana é lavada para remover anticorpos primários ligados de forma não específica
- Os anticorpos ligados são detectados adicionando um substrato e detectando o precipitado colorido formado
O Western blotting é útil na detecção de anticorpos anti-HIV em uma amostra de soro humano. O Western blot também pode ser usado como teste confirmatório para infecção por Hepatite B e teste definitivo para doença da vaca louca.
Figura 03: Western Blotting
Qual é a diferença entre Northern Southern e Western Blotting?
Artigo Diff meio antes da tabela
Northern vs Southern vs Western Blotting |
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| Tipo de molécula detectada | |
| Northern Blotting | O Northern blotting detecta uma sequência específica de RNA de uma amostra de RNA. |
| Southern Blotting | Southern blotting detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. |
| Western Blotting | O Western blotting detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína. |
| Tipo de Gel | |
| Northern Blotting | Este usa gel de agarose / formaldeído. |
| Southern Blotting | Isso usa um gel de agarose. |
| Western Blotting | Isso usa gel de poliacrilamida. |
| Método de Blotting | |
| Northern Blotting | Esta é uma transferência capilar. |
| Southern Blotting | Esta é uma transferência capilar. |
| Western Blotting | Esta é uma transferência elétrica. |
| Sondas Usadas | |
| Northern Blotting | sondas de cDNA ou RNA marcadas radioativa ou não radioativamente. |
| Southern Blotting | As sondas de DNA são marcadas radioativamente ou não radioativamente. |
| Western Blotting | Os anticorpos primários são usados como sondas. |
| Sistema de Detecção | |
| Northern Blotting | Isso é feito usando uma autorradiografia ou detecção de mudança de luz ou cor. |
| Southern Blotting | Isso é feito usando uma autorradiografia, detecção de mudança de luz ou cor. |
| Western Blotting | Isso é feito usando a detecção de mudança de luz ou cor. |
Resumo - Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting é uma técnica especial desenvolvida para a identificação de DNA, RNA ou proteína específicos das amostras. Existem três procedimentos de blotting separados, nomeadamente norte, sul e oeste, para detectar um tipo específico de molécula. A técnica de Northern blotting é projetada para detectar uma sequência de RNA específica de uma mistura de RNA. A técnica de Southern blotting permite a detecção de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA e a técnica de Western blotting é desenvolvida para identificar uma proteína específica de uma mistura de proteínas.
