Diferença chave - primers de PCR vs primers de sequenciamento
Com os desenvolvimentos recentes no campo da biologia molecular, diferentes técnicas genéticas foram desenvolvidas que tornaram os processos de investigação de diferentes vias do assunto fáceis e precisos. PCR e outros procedimentos de sequenciação são duas técnicas importantes. Eles usam subcomponentes diferentes. Os primers são considerados o principal subcomponente comum às técnicas de PCR e sequenciamento. Os iniciadores de PCR são usados para a amplificação de uma sequência de DNA particular, enquanto os iniciadores de sequenciação são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua ordem específica da sequência de nucleotídeos. Esta é a principal diferença entre os primers de PCR e os primers de sequenciamento.
CONTEÚDO
1. Visão geral e diferença chave
2. O que são primers de PCR
3. O que são primers de sequenciamento
4. Semelhanças entre primers de PCR e primers de sequenciamento
5. Comparação lado a lado - primers de PCR vs primers de sequenciamento em forma tabular
6. Resumo
O que são primers de PCR?
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica genética utilizada no campo da biologia molecular para amplificar uma ou algumas cópias de um segmento de DNA específico e obter muitos milhões de cópias idênticas. Em uma reação de PCR, diferentes componentes são usados, incluindo primers. Os primers são fitas curtas de DNA com um comprimento de nucleotídeo de 18-25, tornando-os compatíveis com a região inicial e final dos fragmentos de DNA a serem amplificados. Os primers podem ser um primer direto e um primer reverso. Esses primers se ligam ao fragmento de DNA nos pontos específicos onde faz a DNA polimerase se ligar ao primer específico no local e iniciar a síntese da nova fita de DNA.
A seleção de primers é um aspecto importante do processo de PCR. A seleção do comprimento do primer é importante. O comprimento ideal seria de 18-25 nucleotídeos. Se o comprimento for muito curto ou muito longo, os primers não se ligarão à sequência de DNA a ser amplificada com precisão. Os primers de comprimento muito curto levam a um anelamento inespecífico do primer em diferentes locais da sequência de DNA.
Figura 01: Primers de PCR
O conteúdo de Guanina e Citosina (GC) em um bom primer deve estar na faixa de 40-60. A temperatura de anelamento do primer e a temperatura de fusão são fatores vitais durante a PCR. A temperatura de fusão deve ser calculada com precisão e a temperatura de recozimento do primer deve ser 5 0 C menor que a temperatura de fusão. A temperatura de fusão deve ser 60 ° C e 75 ° C. Temperaturas muito altas ou muito baixas resultarão em uma atividade menos ativa da DNA polimerase.
O que são primers de sequenciamento?
Os primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. Para obter bons resultados de sequenciamento, primers e modelos de alta qualidade são importantes. Portanto, quando os primers são selecionados, eles devem ser exclusivos para uma determinada região onde desejamos sequenciar. Também deve ser com uma orientação correta onde as sequências são geralmente geradas das extremidades 3 'a 5' dos primers. A sequência deve estar sem auto-hibridização indesejável, como a formação de laços em gancho. Não deve conter a formação consecutiva de bases de Guanina.
A temperatura de fusão (Tm) do primer deve ser adequada às condições de sequenciamento. Portanto, deve estar entre 52 o C e 74 o C. A preparação dos oligonucleotídeos a serem usados como primer deve ser purificada para obter o comprimento total desejado da sequência. Se os oligonucleotídeos contiverem impurezas, a sinalização da sequência do iniciador será sobreposta a partir de diferentes locais de iniciação, e também diminuirá o número de células-base.
Figura 02: Primers de sequenciamento
A temperatura de fusão do primer (Tm) de um oligonucleotídeo determina a intensidade da hibridização das fitas complementares de DNA entre si. O Tm pode ser considerado um cálculo termodinâmico, no qual depende tanto das sequências de DNA quanto de várias condições, como a concentração de sal. A Tm é importante durante a PCR, onde uma variante chamada sequenciamento de ciclo é usada para produzir um grupo de fragmentos terminados por didesoxinucleotídeo. Aqui, o primer que é sequenciado será inicialmente recozido alternativamente, depois estendido e por último desnaturado para amplificação. Portanto, o valor de Tm deve estar entre 52 o C e 74 oC. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser obtidos em laboratórios de síntese de DNA / RNA conforme escolha. A pequena escala de síntese usada para o sequenciamento do DNA é geralmente de 50 nmol. Além disso, o mais importante é que os primers usados para o sequenciamento devem ser purificados para ficarem livres de impurezas que irão prevenir a redução da qualidade.
Quais são as semelhanças entre os primers de PCR e os primers de sequenciamento?
- Tanto os primers de PCR quanto os primers de sequenciamento são primers usados no processo de amplificação de uma sequência de DNA alvo.
- Tanto os primers de PCR quanto os primers de sequenciamento são compostos de nucleotídeos.
- Tanto os primers de PCR quanto os primers de sequenciamento são oligômeros curtos.
Qual é a diferença entre primers de PCR e primers de sequenciamento?
Artigo Diff meio antes da tabela
Primers de PCR vs Primers de sequenciamento |
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| Os primers de PCR são cadeias curtas de DNA com um comprimento de sequência de nucleotídeos de 18-25, tornando-os compatíveis com a região inicial e final dos fragmentos de DNA que serão amplificados. | Os primers de sequenciamento são oligômeros curtos que são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. |
| Função | |
| Os primers de PCR são usados para a amplificação de uma sequência de DNA particular. | Os primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. |
| Número de primers necessários | |
| Dois primers; um primer direto e um primer reverso são usados como primers de PCR. | Precisa de apenas um primer como primer de sequenciamento. |
Resumo - primers de PCR vs primers de sequenciamento
Os primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. Um primer de sequenciamento será suficiente para executar o processo. Para obter bons resultados de sequenciamento, primers e modelos de alta qualidade são importantes. Portanto, quando os primers são selecionados, eles devem ser exclusivos para uma determinada região onde desejamos sequenciar. Os primers de PCR são fitas curtas de DNA com um comprimento de nucleotídeo de 18-25 que é compatível com a região inicial e final dos fragmentos de DNA a serem amplificados. Os primers de PCR podem ser um primer direto e um primer reverso. O conteúdo de Guanina e Citosina (GC) em um bom primer deve estar na faixa de 40-60. A temperatura de anelamento do primer e a temperatura de fusão são aspectos vitais durante a PCR. Esta é a diferença entre os primers de PCR e os primers de sequenciamento.
