Diferença chave - PCR vs sequenciamento de DNA
A PCR e o sequenciamento de DNA são duas técnicas importantes em Biologia Molecular. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o processo que cria um grande número de cópias de um fragmento de DNA. O sequenciamento de DNA é a técnica que resulta na ordem precisa dos nucleotídeos de um determinado fragmento de DNA. Esta é a principal diferença entre PCR e sequenciamento de DNA. A PCR é uma das principais etapas envolvidas no sequenciamento do DNA.
CONTEÚDO
1. Visão geral e diferença fundamental
2. O que é PCR
3. O que é sequenciamento de DNA
4. Comparação lado a lado - PCR vs sequenciamento de DNA
5. Resumo
O que é PCR?
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de amplificação de DNA usada em Biologia Molecular. Ele produz de milhares a milhões de cópias de um fragmento de DNA específico. Este método foi desenvolvido por Kary Mullis em 1983. Nesta técnica, o fragmento de DNA a ser amplificado serve como molde e a enzima DNA polimerase adiciona nucleotídeos complementares ao primer que está disponível na mistura de PCR. No final da reação de PCR, muitas cópias da amostra de DNA são sintetizadas.
Existem diferentes componentes da mistura de PCR, incluindo DNA, DNA polimerase (Taq polimerase), primers (primers direto e reverso), nucleotídeos (blocos de construção de DNA) e um tampão. O PCR acontece dentro de uma máquina de PCR e a mistura correta de PCR deve ser carregada na máquina e o programa correto deve ser conduzido. Essa técnica permite a produção de milhares a milhões de cópias de uma seção específica de DNA a partir de uma quantidade muito pequena de DNA.
As reações de PCR ocorrem de maneira cíclica para produzir a quantidade visível de produtos de PCR em um gel. Existem três etapas principais envolvidas em uma reação de PCR, nomeadamente desnaturação, anelamento do primer e extensão da fita, conforme mostrado na Figura 01. Essas três etapas ocorrem em três temperaturas diferentes. O DNA existe na forma de fita dupla por ligações de hidrogênio entre as bases complementares. Antes da implicação, o DNA de fita dupla deve ser separado um do outro. Isso é feito dando uma alta temperatura. Em alta temperatura, o DNA de fita dupla desnatura em fitas simples. Em seguida, os primers devem se aproximar das extremidades flanqueadoras do fragmento específico ou do gene do DNA. O primer é um pequeno pedaço de DNA de fita simples que é complementar à sequência alvo. Os primers forward e reverse recozem com as bases complementares nas extremidades flanqueadoras da amostra de DNA desnaturada na temperatura de recozimento. Os primers devem ser resistentes ao calor. Assim que os primers se anelam com o DNA da amostra, a enzima taq polimerase inicia a síntese das novas fitas adicionando nucleotídeos que são complementares ao DNA alvo. A Taq polimerase é uma enzima termoestável isolada de uma bactéria termofílica chamada Thermus aquaticus. O tampão de PCR mantém as condições ideais para a ação da taq polimerase. Estas três etapas das reações de PCR são repetidas para produzir a quantidade necessária de produto de PCR. Após cada reação de PCR, o número da cópia do DNA é duplicado. Assim, uma amplificação exponencial pode ser observada na PCR. Os produtos de PCR podem ser observados por eletroforese em gel e podem ser purificados para estudos posteriores.
Figura 01: Etapas principais de uma reação de PCR
O PCR é uma ferramenta valiosa na pesquisa médica e biológica. O PCR tem um valor especial na ciência forense, uma vez que pode amplificar DNA para estudos de pequenas amostras de criminosos e fazer perfis de DNA forense. O PCR é amplamente utilizado em muitas áreas da biologia molecular, incluindo genotipagem, clonagem de genes, detecção de mutações, sequenciamento de DNA, microarrays de DNA e testes de paternidade, etc.
Figura 02: Reação em cadeia da polimerase
O que é sequenciamento de DNA?
O sequenciamento do DNA é a determinação de uma ordem precisa dos nucleotídeos - adenina, guanina, citosina e timina em um determinado fragmento de DNA. A informação genética é armazenada nas sequências de DNA usando a ordem correta dos nucleotídeos. Portanto, encontrar a ordem precisa dos nucleotídeos em um fragmento de DNA é muito importante para saber sobre a estrutura e função dos genes.
O protocolo de sequenciamento de DNA envolve diferentes processos. O primeiro passo é o isolamento do DNA interessado ou DNA genômico de um organismo. Usando PCR (como descrito acima), a região desejada do DNA deve ser amplificada. O produto de PCR amplificado deve ser separado pela eletroforese em gel e purificado. Fragmentos amplificados são servidos como modelos para sequenciamento. O sequenciamento pode ser feito seguindo o sequenciamento Sanger ou o método de sequenciamento de alto rendimento. O sequenciamento Sanger requer eletroforese capilar dos fragmentos de DNA resultantes. A determinação da ordem correta dos nucleotídeos pode ser feita por leitura manual de autorradiografias ou usando sequenciadores de DNA automatizados.
O sequenciamento de genes contribuiu para o projeto Genoma humano e facilitou o mapeamento do genoma humano em 2003. Na área forense, o sequenciamento de DNA permitiu a identificação de indivíduos que apresentam sequências de DNA únicas e identificam os criminosos. Na medicina, o sequenciamento de DNA pode ser usado para detectar os genes responsáveis por doenças genéticas e outras doenças, encontrar genes defeituosos e substituí-los por genes corretos. Na agricultura, as informações de sequenciamento de DNA de alguns microrganismos são usadas para produzir safras transgênicas com características economicamente desejadas.
Figura 03: Sequenciamento de DNA
Qual é a diferença entre PCR e sequenciamento de DNA?
Artigo Diff meio antes da tabela
PCR vs sequenciamento de DNA |
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| O processo de PCR cria milhares a milhões de cópias do fragmento de DNA interessado. | Seqüenciamento de DNA é o processo de determinar a ordem precisa dos nucleotídeos em um determinado fragmento de DNA. |
| Resultado | |
| PCR cria milhares a milhões de cópias de um fragmento de DNA particular | Isso resulta na ordem correta das bases em um fragmento de DNA específico. |
| Envolvimento de ddNTPs | |
| O PCR não requer ddNTPs. Ele usa dNTPs. | O sequenciamento de DNA requer ddNTPs para encerrar a formação da fita. |
Resumo - PCR vs sequenciamento de DNA
O PCR e o sequenciamento de DNA são ferramentas muito importantes em muitas áreas da Biologia Molecular. A amplificação dos fragmentos de DNA é feita pela técnica de PCR enquanto a ordem correta dos nucleotídeos de um fragmento de DNA é determinada pelo sequenciamento do DNA. Esta é a diferença entre PCR e sequenciamento de DNA.
